Teknikken i bioteknikk
På denne siden presenterer vi de biologiske molekylene som brukes innenfor bioteknikk og forklarer grunnprinsippene for genteknologi. Deretter tar vi opp noen aktuelle problemstillinger og hvordan disse kan løses med moderne metoder.
Bioteknologien gir nye legemidler
Du har kanskje lagt merke til at de nye beta-interferonene kalles ”rekombinante proteiner”. De fremstilles ved hjelp av bioteknologi.
Beta-interferonene tilhører det voksende antallet legemidler som fremstilles på denne måten, og som nå har blitt en del av vår hverdag. Noen redder liv mens andre forbedrer livskvaliteten til millioner av mennesker.
Til tross for dette vekker disse legemidlene iblant bekymring fordi fremstillingsmetodene bygger på genteknologi. Har du lurt på hvordan ”rekombinante legemidler” fremstilles?
En dypere forståelse av bioteknologiens grunnlag og metoder kan kanskje bidra til å dempe engstelse og usikkerhet ved å skape innsikt i hvorfor denne metoden er så verdifull.
En definisjon av bioteknologi
bi-o-tek-no-lo-gi
Utviklingen av teknikker som benytter biologiske prosesser i fremstillingen av materialer for medisinsk og industrielt bruk. Eksempelvis er fremstillingen av mange antibiotika avhengig av ulike soppers og bakteriers aktivitet. Nye genteknologiske metoder har muliggjort storskalaproduksjon av hormoner, vaksiner, interferoner og andre nyttige produkter.
The Oxford Concise Medical Dictionary
Verdien av bioteknologi - derfor er proteiner livsviktige
Mange av bioteknologiens produkter er ”rekombinante proteiner”.
Proteiner er livsviktige strukturelle og regulerende molekyler, og enkelte av dem kan benyttes innenfor medisinen. Eksempelvis kan man bruke humanproteiner til å behandle sykdommer som forårsakes av proteinmangel.
Man har lenge vært kjent med humane proteiners verdi i behandlingen av sykdommer, men det er bare mulig å utvinne meget små mengder protein fra menneskets vev.
Takket være bioteknologien kan man imidlertid nå produsere tilstrekkelige mengder humanproteiner av så god kvalitet at de kan brukes innenfor medisinen.
Grunnprinsippet er enkelt: DNA i genene koder for en mal som kalles RNA, og som i sin tur koder for proteiner (se diagrammet). Bioteknologien tar i bruk dette prinsippet i storskalaproduksjon av legemidler.
De første trinnene
For å forstå hvordan bioteknologi kan anvendes til å fremstille terapeutiske proteiner, skal vi gå tilbake til 1944 da vitenskapsmenn oppdaget at genetisk informasjon finnes lagret i deoksyribonukleinsyre (DNA) i cellekjernen, ikke i proteiner som man tidligere hadde trodd.
Denne oppdagelsen representerte et gjennombrudd fordi den var det første skrittet mot bioteknologiens aller viktigste prinsipp, nemlig at gener bærer en kode for proteiner.
I 1953 viste Crick og Watson hvordan dette kunne fungere gjennom å desifrere selve DNA-strukturen ved hjelp av eksperimentelle data som ble fremskaffet av Maurice Wilkins og Rosalind Franklin. I 1962 ble de belønnet med Nobelprisen i medisin for sitt arbeid.
Crick og Watson viste at DNA består av to meget lange kjeder av enkle, tilbakevendende enheter, som slynger seg om hverandre i en dobbelheliks. Hver kjede har en ”ryggrad” og fra den skyter ulike ”pinner” (baser) innover, som i en vindeltrapp. Det finnes fire ulike baser: adenin, guanin, tymin og cytosin. På grunn av deres strukturelle og elektriske egenskaper danner adenin alltid par med tymin og cytosin med guanin.
Koden knekkes
Crick og Watson innså konsekvensene av DNA-kjedens struktur. Dersom man trekker fra hverandre dobbelheliksen får man to enkle kjeder. Basenes måte å danne par på innebærer at hver og en av enkeltkjedene utgjør en mal, og ved hjelp av denne kan det fremstilles en eksakt kopi av modermolekylet.
Dette er viktig ettersom arvelighet skyldes eksakt reproduksjon. I bildet til høyre ser du at dette er innebygget i DNAs struktur.
- Opprinnelig modermolekyl
- Første generasjons dattermolekyl
- Andre generasjons dattermolekyl
Crick og Watson foreslo at sekvensen av baser i DNA-molekylet på en eller annen måte koder for proteiner.
På begynnelsen av 1960-tallet knekte forskerne endelig den genetiske koden. De viste at enheten for genetisk informasjon er en sekvens av tre baser, kalt et kodon. Hvert kodon bestemmer en eneste aminosyre.
DNA-koden for proteiner
Det finnes 21 ulike aminosyrer og disse er alle proteiners grunnleggende byggesteiner. I et protein bindes aminosyrene sammen ende mot ende til en lang streng, som er vridd til en kompleks tredimensjonal form. En kodonsekvens i DNA, som bestemmer hele sekvensen av aminosyrer i et protein, kalles for et gen. En typisk menneskecelle har ca. 100 000 gener i sitt DNA.
Slik dannes et protein
Ved dannelsen av et protein skilles de to DNA-strengene fra hverandre i hele genets lengde. Derigjennom blottlegges en mal på hvilken en datternukleinsyre, kalt ribonukleinsyre (eller RNA), som kan dannes av enzymet RNA-polymerase.
Denne prosessen kalles transkripsjon, fordi genetisk informasjon transkriberes, eller ”skrives med et annet skriftsystem” (se bildet).
RNA
Når RNA-strengen er dannet vandrer den fra kjernen til cytoplasmaets store proteinbyggende fabrikker – ribosomene – som oversetter sekvensen av kodon til den spesifiserte strengen av aminosyrer slik at de danner et protein. Denne prosessen kan sammenlignes med å oversette instruksjoner fra ett språk til et annet.
Ribosomer
Fra ribosomene mates nydannede proteiner inn i en forpakningsfabrikk – det endoplasmatiske retiklet – der de dekkes med kullhydratkjeder slik at det dannes et funksjonelt proteinkompleks. Denne endelige pakkingen kalles glykosylering. Den har viktige konsekvenser for bioteknologien, som vi senere kommer til å se.
Bioteknologiens gjennombrudd
Alle celler benytter samme maskineri til å fremstille proteiner ved hjelp av DNA, t.o.m. meget enkle celler som bakterier. Faktum er at bioteknologien ble mulig først da flere viktige proteiner (enzymer) ble oppdaget i bakterier og virus på begynnelsen av 1970-tallet. Til disse hører:
- restriksjonsendonukleaser (som kapper DNA på visse steder)
- DNA-ligaser (som limer sammen DNA-fragmenter ende mot ende)
- revers transkriptase (som vender transkripsjonen fra RNA til DNA)
Disse enzymene er bioteknologiens verktøy. De kan brukes til å kløyve og deretter rekombinere viktige humane gener med bakteriers DNA.
Rekombinasjon av humane og bakterielle gener utgjør grunnen for rekombinant DNA-teknikk, som er bioteknologiens sentrale prinsipp. Dette er en verdifull teknikk fordi bakterier deler seg svært raskt. Under riktige forhold fordobles antallet bakterier hver 20. minutt. Dette innebærer at de kan brukes til å fremstille store mengder protein til medisinsk bruk.
Den moderne syntesen
Ved fremstilling av et rekombinant protein isolerer man først humant DNA og deler det opp ved hjelp av et restriksjonsendonuklease. På den måten får man en mengde karakteristiske DNA-fragmenter som inneholder visse gener.
Deretter gjentar man prosessen med bakterielt DNA, hvorav en del finnes i sirkelformede strukturer kalt plasmider. Hvis man benytter riktig ”kniv” er det vanligvis tilstrekkelig å skjære av spiralen på bare ett sted.
Deretter blander man et fragment av humant DNA, som bærer det genet man behøver, med den åpnede bakterielle plasmiden.
Plasmider
Til slutt rekombinerer man de humane og bakterielle fragmentene med en DNA-ligase for å skape et nytt plasmid som inneholder det menneskelige genet.
Når et rekombinant DNA-plasmid er fremstilt må den transplanteres tilbake inn i bakteriene slik at den kan brukes til å produsere det aktuelle proteinet. Denne teknikken kalles transfeksjon. Bakterier som inneholder det menneskelige genet i sine plasmider dyrkes i cellekultur og begynner å syntetisere det humane rekombinante proteinet med det egne cellulare maskineriet.
Tenke stort
Å fremstille et rekombinant protein med disse metodene for medisinsk bruk i industriell skala er teknisk meget krevende, med bl.a. varsom materialhåndtering og avansert kvalitetskontroll.
De viktigste produksjonstrinnene er:
- fermentering – bakterier dyrkes i en serie lukkede fat med en næringsbuljong (kultur)
- høsting – etter fermenteringen utvinner man proteinet fra cellene ved å sentrifugere dem
- raffinering – det aktuelle proteinet isoleres fra ca. 5 000 normale bakterielle proteiner med slike teknikker som kjemisk utfelling og kromatografi
- formulering – det aktuelle proteinet modifiseres til en stabil, steril form, som kan gis terapeutisk. Husk at proteiner ikke kan tas som piller, fordi de brytes ned i magen.
Overføringen fra laboratoriets prøverør til industriell fermentering er ikke alltid en ukomplisert prosess. Hvert og ett av produksjonstrinnene krever stadig flere manipulasjoner for å maksimere utbyttet av legemiddelet, renhetsgrad, aktivitet og stabilitet.
Dette er enkelt med visse stoffer, som bare krever noen få prosessjusteringer. Andre er vanskeligere og krever mer tid og oppmerksomhet, noe som kan medføre at kostnaden på sluttproduktet øker. Men den blir aldri høyere enn kostnaden for å isolere medisinske mengder av stoffene fra opprinnelseskilden, om dette i det hele tatt var mulig.
Bakterier eller virus?
Ved fremstilling av rekombinante proteiner for terapeutisk bruk avhenger renhetsgraden, utbyttet, biologisk aktivitet og stabilitet også av typen av celle som brukes til å fremstille proteinet.
Nå for tiden kan mange ulike typer celler og bakterier brukes. Man kan eksempelvis benytte et virus til å føre inn menneskelige gener i pattedyrs- eller insektcellers DNA, og dyrke disse i en kultur.
Enkelte av disse cellene vokser ikke spesielt bra i kultur, og de fleste av dem (bl.a. bakterier) produserer noe forandrede proteiner som ofte ikke er like terapeutisk effektive som det naturlige humanproteinet.
Et vanskelig dilemma
Den åpenbare løsningen på problemet med rekombinante proteiners reduserte aktivitet er å dyrke proteinene i menneskeceller.
Dessverre er det ikke mulig å dyrke menneskeceller under de forhold som råder ved industriell fermentering, og selv om de dyrkes i liten skala produserer de ikke mye protein. Men takket være DNA-kodens struktur er det en vei ut av dette dilemmaet.
Som tidligere sagt utgjør en triplett av baser koden for en aminosyre. Hvis man endrer et eneste kodon i DNA kan man endre proteinets aminosyresekvens.
Akkurat som i evolusjonen er de fleste strukturforandringer av proteiners aminosyresekvens skadelige. Iblant kan de imidlertid føre til at originalen forbedres. En eneste forandret aminosyre kan forbedre proteinet så mye at det får samme terapeutiske aktivitet og stabilitet som det naturlige humanproteinet.
(bildet viser en molekylær struktur hos Interferon beta - 1b)
Et blikk inn i fremtiden
Når gener modifiseres for å fremstille et protein med en noe annerledes aminosyresekvens mister man ikke noe av utbyttet, ettersom det nye rekombinante proteinet kan dyrkes i bakterier, som deler seg raskere enn noen annen type av celler.
Det finnes allerede en hel serie av modifiserte (andre generasjons) rekombinante proteiner for medisinsk bruk, deriblant nye former for insulin, veksthormon, vevsplasminogen-aktivator, faktor VIII og interferon-beta-1b.
Dette gir nytt håp for fremtiden. Endelig er det mulig å påvirke forløpet ved sykdommer som MS. Nå når bioteknologien gjør det mulig å fremstille store mengder terapeutisk protein, kan alle som behøver det tilbys effektive behandlinger som beta-interferon.
